刘翼振课题组在自然指数期刊《Analytical Chemistry》发表具备内控的单管单酶多重CRISPR核酸检测方法研究 – 分子诊断与传感技术实验室 @Shenzhen University （Xili Campus）

深圳大学化学与环境工程学院刘翼振副教授团队近日在《Analytical Chemistry》期刊（中科院大类一区，TOP期刊）发表了题为“A Single-Tube, Single-Enzyme Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats System (UNISON) with Internal Controls for Accurate Nucleic Acid Detection”的研究成果。这一突破性研究提升了CRISPR技术在核酸检测中的准确性，具有重要的临床应用潜力。

研究背景

在核酸检测中，内部控制对确保结果的精确性和可靠性至关重要。内控可有效监测反应体系的有效性并减少操作误差，从而提高检测准确性。然而，尽管CRISPR技术因其高特异性和便捷性在分子诊断中备受关注，但在多重检测中，非特异性切割活性常导致信号干扰，限制了内部控制的应用。面对这一技术痛点，刘翼振团队通过创新性地修饰crRNA，开发出全新的单管单酶统一核酸检测系统（UNISON），致力于攻克CRISPR技术在走向临床核酸检测中存在的难题，为精准医疗检测提供更为可靠的解决方案。

研究内容

创新技术体系

刘翼振团队通过对crRNA进行修饰，开发了单管单酶统一核酸检测系统（UNISON）。该系统将LbuCas13a-crRNA的3’端延长形成回折结构，并修饰荧光和淬灭基团（FBcrRNA）。不同通道的FBcrRNA采用不同的荧光与猝灭基团，以区分信号。无靶标时，FBcrRNA结构稳定且无荧光信号；有靶标时，靶标与FBcrRNA配对并置换荧光团，激活Cas蛋白产生荧光信号，从而实现双重检测且信号通道互不干扰。

实验验证

可行性验证：通过组分缺失实验验证了 UNISON 系统中 FBcrRNA 回折结构与 Cas13a 蛋白反式切割活性的协同作用。实验表明，该系统适用于多重 DNA 靶标检测，为解决传统 CRISPR 检测技术通道干扰问题提供新策略。

灵敏度与特异性提升：结合不对称 PCR 扩增，以 HBV 检测为例，单重检测体系灵敏度可达 100 copies/μL，且对其他传染病样本检测显示良好特异性。

内控检测体系验证：将 UNISON 系统用于带内控的核酸检测，通道 1 作内控验证试剂有效性和减少误差，通道 2 检测 HBV。实验证明该系统可靠性良好，在临床样本检测中，UNISON 检测结果与 qPCR 方法完全相同，表现优异且具应用于多种病原体检测潜力。

研究亮点

实现 CRISPR 多重核酸检测

通过对 crRNA 修饰，克服传统 CRISPR 多重检测干扰问题，实现双重核酸检测，未来可拓展至多重检测场景。这为临床同时检测多种病原体或疾病相关基因标记物提供了可能，在复杂疾病的诊断中，能够一次性获取更多关键信息，减少患者多次检测的痛苦，加快疾病诊断速度，为临床精准医疗提供有力支持。

实现带内控的 CRISPR 核酸检测

单管内用一种 Cas 蛋白实现双重检测，可验证试剂有效性、校正系统误差，使核酸检测更准确。内控机制的实现，极大地提高了检测结果的可信度，在临床应用中，有助于保证检测质量的稳定性，避免因试剂批次差异或实验操作微小变动对检测结果的影响，从而确保临床诊断的准确性，降低误诊和漏诊风险。

高灵敏度与特异性

结合不对称 PCR 扩增，能检测低浓度乙肝病毒，在有其他传染病干扰时仍具良好特异性。高灵敏度保证了在疾病早期或病原体载量较低时能够及时发现，这对于传染病的防控尤为重要，可尽早采取隔离、治疗等措施，防止疾病传播。而良好的特异性则避免了其他类似病原体或物质的干扰，确保检测结果针对目标病原体或基因，为临床治疗提供精准方向。

临床检测可行

在临床样本检测中表现出色，具备应用于多种病原体检测潜力。这表明 UNISON 系统在临床实践中具有广泛的适用性，不仅局限于乙肝病毒检测，还能为呼吸道传染病等多种疾病的诊断提供可靠方法，有助于提升临床检测水平，加强公共卫生体系应对各类传染病的能力。

未来展望

本研究为 CRISPR 准确检测提供新方案，展示其在临床诊断领域的巨大潜力。UNISON 系统扩展性强，可检测更多病原体、基因突变或生物标志物，适用于复杂生物样本，有望成为临床诊断、个性化医疗和病原体筛查的理想平台，为现代分子诊断带来创新解决方案。未来，随着技术的进一步发展，UNISON 系统有望在临床应用中发挥更大作用，如实现对癌症相关基因突变的早期筛查，助力癌症的早期诊断和治疗；在传染病大流行期间，快速准确地检测病原体，为疫情防控提供有力支持，从而在保障人类健康方面发挥更为重要的作用。

论文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c03403

本研究得到科技部国家重点研发计划、广东省自然科学基金面上项目和深圳市科技计划稳定支持项目的大力资助。